蒲公英花提取物的体外抗肿瘤活性研究
文
陈红林乔华孙体健
摘要
目的研究蒲公英花提取物的不同溶剂萃取部分的体外抗肿瘤作用。
方法设蒲公英花提取物的各萃取部位的不同浓度组，细胞对照组及空白对照组，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法考察蒲公英花提取物的各萃取部位在不同时间内对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用，并采用显微镜观察药物对上述细胞株细胞形态的影响。
结果蒲公英花提取物的各萃取部位在体外对肝癌细胞HepG2有比较显著的细胞增殖抑制作用，呈现明显的剂量-时间-效应关系；并且可使肿瘤细胞株的细胞形态发生显著变化，引起细胞株的凋亡或坏死。
结论蒲公英花提取物的各萃取部位能抑制肝癌细胞HepG2的增殖，在体外有一定的抗肿瘤活性。
关键词蒲公英；植物提取物；抗肿瘤活性；细胞抑制率
正文
蒲公英为菊科植物蒲公英、碱地蒲公英或同属数种植物的干燥全草。蒲公英在我国分布广泛，每年春秋两季开花，资源丰富，蒲公英全草味甘苦，性寒，具有清热解毒、散结消肿、利尿通淋的功效，临床应用广泛，主要用于疖疮肿痛乳痈及胃痈等症［1，2］。近年来，药理实验研究发现，蒲公英还具有抗菌、消炎止痛、保肝利胆、抗肿瘤等作用［3，4］，蒲公英花中含有毛莨黄素，叶酸及维生素B2等许多人体必需的营养成分［5］，对促进人体健康大有裨益，而蒲公英花茶也逐渐成为人们及商家青睐的养生保健茶品［6］。经前期研究发现，蒲公英花中还含有较丰富的黄酮类及酚酸类化合物等［7，8］，而这些化合物在抗氧化抗肿瘤抗菌消炎利胆保肝等方面均具有较强的生物活性［8，10］。因此，在医药品、食品、保健品等研究方面具有很大的开发价值及应用潜力。
本实验对蒲公英花各提取部位的体外抗肿瘤活性作初步研究，筛选出抗肿瘤的活性部位，以期为临床抗肿瘤药物的开发和应用提供理论依据。
材料与方法
1
材料与试剂
蒲公英花采自太原地区野生种类（经山西医科大学生药教研室鉴定为蒲公英的花），去掉花托，阴凉通风处干燥，粉碎，备用。人肝癌细胞株（HepG2）（中国科学院上海细胞生物学研究所）。四甲基偶氮唑蓝（MTT，Solarbio公司）；二甲基亚砜（DMSO，北京索莱宝科技有限公司）；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（0．25％，北京索莱宝科技有限公司）；特级胎牛血清（澳洲血源，北京元亨金马生物技术开发有限公司）；达氏修正依氏培养基（DMEM）；高糖细胞培养液（NeuronbcLaboratoriesCo．ltd）；青链霉素混合液（×，北京索莱宝科技有限公司）；乙醇、乙酸乙酯、石油醚等均为分析纯。
2
仪器
KQ-DE型超声波清洗器（40KHz，江苏省昆山市超声仪器有限公司）；BS-S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；N-0型旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；二氧化碳培养箱（美国A-shevilleNC公司）；GB-Ⅱ超净工作台（北京新技术应用研究所）；NovapathTM酶联免疫检测仪（美国Bio-RAD公司）。
3
实验方法
供试品的制备：将蒲公英花风干、去掉花托、粉碎，精密称定，加入10倍量蒸馏水在功率为W55℃下超声提取30min，提取3次，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得到浸膏（水相）备用。滤渣再用10倍量75％乙醇作溶剂，在以上条件下超声提取3次，合并提取液，于旋转蒸发器中蒸发浓缩至无乙醇味，依次用体积比1∶1石油醚、乙酸乙酯各萃取3次，分别得到萃取液，减压浓缩，真空干燥，得到上述溶剂萃取浸膏，备用。
细胞培养：肝癌细胞HepG2由本实验室液氮留存，培养液选用DMEM高糖细胞培养液，其中包含10％胎牛血清和1％青霉素链霉素混合液（青霉素和链霉素各Um），于恒温CO2细胞培养箱（37℃，体积分数为5％CO2）中培养，待细胞贴壁生长约90％传代培养，取对数生长期细胞用于实验。
实验分组及处理：实验分为细胞对照组、溶剂对照组和实验组：1.细胞对照组：将HepG2单细胞悬液接种于96孔板中，正常培养。2.溶剂对照组：将HepG2单细胞悬液接种于96孔板中，培养24h后，弃去旧培养液，加入含3％乙醇的培养基，继续孵育24/48及72h后检测细胞存活率。3.实验组：同溶剂对照组处理，只是将含3％乙醇的培养基换为以含3％乙醇的培养基溶解的不同浓度（0．3，0．6，0．9，1．2，1．5μg/μl）的蒲公英花在水相、石油醚相、乙酸乙酯相浸膏稀释液。以上各组均设6个复孔用于检测。
HepG2细胞的形态学观察和细胞活力检测：
将各组处理后的细胞孵育完毕后，取出96孔板，对各组细胞进行拍照，拍照完成后弃去旧培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞2次，向每孔中加入μL的新培养液及10μL0．01mol/L的MTT贮存液,继续孵育4h后，于显微镜下可见有紫色结晶生成，弃去原培养液，在每孔中加入DMSOμL，于摇床上振荡10min,待结晶溶解后，将96孔板置于酶联免疫检测仪中，以含纯DMSOμL的孔为调零孔，nm为检测波长测定各孔的吸光度，HepG2细胞的抑制率用如下公式计算：
其中［A］i为细胞对照组的吸光度值；［A］t为其余各处理组的吸光度值；［A］o为调零孔的吸光度值。
结果
蒲公英花提取物对肝癌细胞HepG2增殖的影响：分别观察不同浓度（0．3，0．6，0．9，1．2，1．5μg/μL）的各相蒲公英花提取物作用于HepG2细胞，24、48及72h后对其增殖的影响，见表1。由表1可见，蒲公英花各相提取物对HepG2细胞生长的抑制能力依次顺序为：乙酸乙酯相＞水相＞石油醚相，其中乙酸乙酯相对HepG2细胞的抑制率最高；蒲公英花提取物分离出的各相分别作用于HepG2细胞，24、48及72h，并且随其浓度的增加和作用时间的延长，细胞生长的抑制率逐渐升高，呈现较好的剂量-时间-效应关系；乙酸乙酯相、水相及石油醚相中的最大抑制率分别达89．5％、82．5％及61．9％，其半数抑制率（IC50）分别为0．39、0．69及1．14μg/μL，空白对照组对肝癌HepG2细胞的抑制率为0。
蒲公英花提取物作用前后HepG2细胞增殖的形态学变化：根据上述结果，乙酸乙酯相提取物对HepG2细胞的抑制率较高；在显微镜下观察乙酸乙酯萃取部位分别作用24、48及72h后，HepG2细胞形态的变化见图1。由图1可见，正常的HepG2细胞贴壁生长，轮廓清晰，呈梭形与多边形，可观察到部分细胞细微结构。而实验组乙酸乙酯相对肿瘤细胞的作用后较其他两相活细胞数量较少，部分细胞收缩变圆漂浮于培养液中；随着作用时间的延长，活细胞数减少，细胞肿胀或皱缩变圆，悬浮细胞增多，背景上细胞碎片明显增加。
讨论
现代研究表明，蒲公英的药理活性多样，具有抗菌消炎、保肝利胆、消肿散结、抗氧化及抗肿瘤等作用［4］。蒲公英主要含有胡萝卜素类、脂肪酸类、三枯类、香豆素类、黄酮类及酚酸类化合物等，其中，发挥药理活性的主要成分为黄酮类化合物［2］，具有抗肿瘤作用的黄酮类化合物主要有槲皮素、水飞蓟素芦丁和柚皮苷等，其中已有多个化合物作为抗肿瘤药物应用于临床。其抗癌、防癌的机制主要包括抑制自由基和致癌因子的产生、抑制癌细胞和肿瘤血管的生长以及提高机体免疫力等方面［11］。
MTT法简便快速，常用于初筛抗肿瘤活性部位或药物的体外试验［12］。本试验采用MTT法对蒲公英花的石油醚、乙酸乙酯和水萃取部分进行体外抗肿瘤活性进行初步研究，结果表明，蒲公英花提取物的各萃取部位对HepG2细胞有不同程度的抑制作用，并且呈现良好的剂量-时间-效应关系；其中乙酸乙酯相对HepG2细胞的抑制率最高。而经本课题组前期研究，蒲公英花乙酸乙酯相中黄酮含量在90％以上，其抗肿瘤作用优于其他2组，证明了黄酮类成分具有良好的癌细胞抑制活性，究竟是哪种黄酮类化合物起到抗癌作用还有待进一步的研究。水相中黄酮含量较低，同样表现出了较好（与乙酸乙酯相相近）的癌细胞抑制活性，可能是其中所含多糖类成分所起到的作用［13，14］。蒲公英花提取物在体外实验有一定的抗肿瘤作用，但其抗肿瘤作用的真正机制以及在体内抑制肿瘤的实验有待进一步研究。
参考文献
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